Электронный микроскоп что можно увидеть

Электронный микроскоп в гараже

Позвонил мне как-то друг и говорит: нашёл интересную штуку, нужно привезти к тебе, весит полтонны. Так у меня появилась колонна от сканирующего электронного микроскопа JEOL JSM-50A. Её давно списали из какого-то НИИ и вывезли в металлолом. Электронику потеряли, а вот электронно-оптическую колонну вместе с вакуумной частью удалось спасти.

До этого момента я не имел дела с подобным научным оборудованием, не говоря уже о том, чтобы уметь им пользоваться и представлять, как оно работает. Чтобы восстановить этот микроскоп хотя бы до состояния «рисуем электронным лучом на люминесцентном экране» потребуется:

• Понять основы работы электронных микроскопов
• Разобраться в том, что такое вакуум, какой он бывает
• Как измеряют вакуум, как его получают
• Как работают высоковакуумные насосы
• Минимально разобраться в химии (какие растворители использовать для очистки вакуумной камеры, какое масло использовать для смазки вакуумных деталей)
• Освоить металлообработку (токарные и фрезерные работы) для изготовления всевозможных переходников и инструментов
• Разобраться с микроконтроллерами, схемотехникой их подключения

Восстановление микроскопа после как минимум десятка лет — под катом.

DISCLAIMER: Помните, безопасность превыше всего! Я не несу никакой ответственности за то, что вы случайно нанесёте вред своему здоровью или создадите чёрную дыру, используя знания из этой статьи

Интересно не просто запустить старую железяку в рабочее состояние, но и проверить, возможно ли используя научный метод освоить совершенно новые области.

Поэтому прежде, чем что-то делать, всегда полезно понять, как оно работает.

Принципы работы электронных микроскопов

Есть два типа электронных микроскопов:

• просвечивающий (TEM или ПЭМ)
• сканирующий (SEM или РЭМ от «растровый»)

Просвечивающий электронный микроскоп

ПЭМ очень похож на обычный оптический, только исследуемый образец облучается не светом (фотонами), как в оптическом микроскопе, а электронами.

Длина волны электронного луча намного меньше, чем фотонного, поэтому можно получить существенно большее разрешение.

Фокусировка и управление электронным лучом осуществляется с помощью электромагнитных или электростатических линз. Им даже присущи те же искажения (хроматические аберрации), что и оптическим линзам, хотя природа физического взаимодействия совершенно иная. Она, кстати, добавляет ещё и новых искажений (закручивание электронов в линзе вдоль оси электронного пучка, чего не происходит с фотонами в оптическом микроскопе).

У ПЭМ есть недостатки: исследуемые образцы должны быть очень тонкие, тоньше 1 микрона, что не всегда удобно в домашних условиях. Например, чтобы посмотреть свой волос на просвет, его нужно разрезать вдоль хотя бы на 50 слоёв. Это связано с тем, что проникающая способность электронного луча гораздо хуже фотонного. К тому же, ПЭМ за редким исключением достаточно громоздки. Вот этот аппарат, изображённый ниже, вроде бы и не такой большой (хотя выше человеческого роста, и имеет цельную чугунную станину), но к нему идёт ещё блок питания размером с большой шкаф, итого занимая целую комнату.

Но разрешение ПЭМ — наивысшее. С помощью него (если сильно постараться) можно увидеть отдельные атомы вещества. (Фото отсюда).

Особо полезно такое разрешение для идентификации возбудителя вирусного заболевания. Вся вирусная аналитика 20 века была построена на базе ПЭМ, и только с появлением более дешёвых методов диагностики популярных вирусов (напр. ПЦР), рутинное использование ПЭМов для этой цели уже не встречается.

Например, вот как выглядит грипп H1N1 «на просвет»: (фото отсюда)

Сканирующий электронный микроскоп

SEM применяется в основном для исследования поверхности образцов с очень высоким разрешением (увеличение в миллион крат, против 2 тысяч у оптических). А это уже гораздо полезнее в хозяйстве 🙂

К примеру, кто-то смотрит на новую зубную щётку:

В сканирующем микроскопе узко сфокусированный электронный луч «сканирует» поверхность образца точка-за-точкой, а всевозможные датчики улавливают то, что вылетает из образца после ударов электронами.

— электроны с различными энергиями
— оптическое излучение видимого, инфракрасного, ультрафиолеотового диапазонов
— рентгеновское излучение
— неведомая хрень

Принцип работы сканирующего электронного микроскопа немного похож на работу электронно-лучевой трубки телевизора (в которой есть и глубокий вакуум, и электронная пушка, и система фокусирующих и отклоняющих линз). Вот, кстати, как он работает при съёмке 1000 кадр/с:

То же самое должно происходить и в электронно-оптической колонне микроскопа, только облучается образец, а не люминофор экрана, и изображение формируется на основе информации с датчиков (вторичных электронов, упруго-отражённых электронов, и прочих).

И кинескоп телевизора, и электронно-оптическая колонна микроскопа работают только под вакуумом.

Вдохновившись картинками, приступаем к работе.

Электронно-оптическая колонна

Электронно-оптическая колонна микроскопа — это вакуумная камера, в которой расположены:

• электронная пушка, испускающая электронный луч
• система электромагнитных линз, фокусирующих, сдвигающих, раскручивающих и перемещающих луч
• держатель для образца, с возможностью его перемещения и наклона по разным осям
• детекторы излучения различной природы — электронов, рентгеновского, светового диапазонов
• порты для подключения дополнительных устройств
• система управления вакуумом

Управляемый предметный столик (расположен внутри колонны, доступ к нему через специальный шлюз, снаружи его расположение можно узнать по обилию ручек для перемещения и наклона)

I. Разборка, очистка, покраска

Самое первое, что захотелось сделать — это всё основательно отмыть и покрасить поржавевшие детали. Защитные кожухи сверху и сбоку были сняты, под ними оказалось ещё больше пыли, а сталь успела местами соржаветь от действия влаги и воздуха. Хорошо, что сама колонна сделана из нержавейки и так легко не окисляется.

Вакуумная часть (под колонной) в процессе разборки выглядела как-то так:

Снимаем снизу всю вакуумную арматуру, остатки блока управления вакуумом, диффузионный насос, зачищаем и красим дно полуматовой чёрной краской, чтобы было красиво. Сверху снимаем защитные кожухи, видим тридцатилетнюю пыль, всё моем, шкурим и красим. Вот было/стало для сравнения:

Разобравшись с железяками я разблокировал антивибрационную пружинную подвеску колонны и попробовал вывесить колонну в рабочее положение (двухсантиметровый стальной лист и несколько утяжелителей обеспечивают солидность покачивания).

Все части проекта:

• 2. «Про вакуум» — что это такое, как его получают и измеряют
• 3. Оборудуем гараж станками для обработки металла
• 4. Откачаем колонну до форвакуума
• 5. Восстанавливаем диффузионный насос и получаем высокий вакуум
• 6. Ставим катод и готовим колонну к запуску
• 7. Разбираемся с высоковольтным блоком
• 8. Разгоняем электроны
• 9. Захват изображения
• 10. Детекторы вторичных электронов,
  история их разработки

А также смотрите видео на моём канале.

Жду ваших комментариев и вопросов, до встречи в следующих сериях!

• электронный микроскоп
• в гараже
• вакуум
• сканирующий электронный микроскоп
• JEOL

• Гаджеты
• Научно-популярное
• Старое железо
• Физика
• DIY или Сделай сам

Как ловили электроны: таймлайн развития электронной микроскопии

Эта статья — продолжение серии материалов про электронный микроскоп в гараже. На всякий случай вот ссылка на первый выпуск.

Наш проект подошёл к тому этапу, когда нужен детектор (электронов, вторичных или упруго-отражённых). Но прежде расскажу вам, зачем именно этот детектор нужен и как учёные пришли к его современной конструкции.

Для наглядности сделаем это в виде таймлайна.

1873 — 1878 гг

Рассматривая распространение света как волновой процесс, Ernst Abbe был огорчён невозможностью преодоления дифракционного предела в то время. «Остаётся только утешаться тем, что человеческий гений когда-нибудь найдёт пути и средства для преодоления этого предела. » [1]

1935 г.

К этому моменту учёные поняли, что длина волны электронного луча настолько мала, что позволит построить микроскоп, значительно превосходящий оптический микроскоп.
В этом году Max Knoll (и Ernst Ruska) впервые получил изображение просканировав поверхность образца электронным лучом. Никакой дополнительной системы фокусировки электронного луча не было, поэтому наименьший диаметр луча, который удалось получить составил 100мкм.
[2]

Ток луча измерялся микроамперами, поэтому можно было усиливать сигнал с проводящего образца с помощью уже разработанных тогда электронных ламп. Вот так и появился детектор поглощённого тока (absorbed current / specimen current).

На самом деле Knoll получил настоящее изображение во вторичных электронах. Потому, что поглощённый образцом ток — сколько электронов в него ударилось (сканирующий луч) минус те, что отлетели или были вторично эмитированы.

Увеличение варьировалось от 1х до 10х путём изменения амплитуды колебаний электронного луча в микроскопе (что кстати ранее продемонстрировал В. Зворыкин в оптическом микроскопе, оснащённом телевизионной камерой). Для получения большего увеличения нужно уменьшать диаметр луча.

Изображение ферросилиция из [3].

Отличие от световой микроскопии

Отсюда диаметральная противоположность световой и электронной микроскопий: если в световой нужно увеличить изображение образца (просвечивающее или отражённое), то в электронной нужно как можно сильнее уменьшить изображение источника излучения. Исключение составляют лишь просвечивающие электронные микроскопы, но об этом я уже писал.

1937 г.

Разработаны современные электростатические фотоэлектронные умножители, далее для краткости — ФЭУ. Разработка ФЭУ в США велась корпорацией RCA, в которой также работал и В.Зворыкин над электронным микроскопом.

Пример ФЭУ с подключённой электроникой. Тот самый ФЭУ производства RCA, тип 4517.

ФЭУ — это очень чувствительное устройство, пригодное для регистрации отдельных фотонов. Его коэффициент усиления составляет порядка 100 миллионов.

Принцип действия очень простой. Через входное окно из кварцевого стекла фотоны попадают на фотокатод.

Фотокатод эмитирует электроны, которые летят к специальным электродам — динодам, расположенным последовательно. Коэффициент вторичной эмиссии динодов больше единицы: влетел один электрон, а вылетело больше одного. Таким образом получается лавинообразное увеличение количества электронов, которые в конце достигают анода, с которого и снимается полезный сигнал. Между динодами поддерживается разность потенциалов с помощью резистивного делителя, поэтому ФЭУ и называется электростатическим.

В этом ФЭУ диноды расположены нелинейно:

1938 г.

Manfred von Ardenne применил уже открытые электростатические и электромагнитные линзы (на рисунке сверху они показаны для фокусировки луча в электронно-лучевой трубке) для уменьшения диаметра электронного луча вплоть до 4 нм.

Но ток луча стал таким маленьким ( A, т.е. около 0.1 пА), что усилить его с помощью тёплого лампового усилителя было невозможно: полезный сигнал был гораздо меньше шума.

Пришлось записывать получаемое изображение на просвет (или на отражение) на плёнку, со временем экспозиции около 20 минут. Для наведения фокуса была отдельная система с цельным кристалликом сульфида цинка, рассматриваемого в оптический микроскоп.

1942 г.

В тоже самое время над электронным микроскопом работал Владимир Зворыкин. Он сконструировал сканирующий электронный микроскоп в современном его понимании: электронно-оптическая колонна, камера с образцом, вакуумная система. Сканирование по стандарту на ТВ в то время в США: 441 строка, 30 кадр/с. Но при уменьшении диаметра луча меньше 1 микрона ток становился слишком маленьким и в результате усиления был только шум.

Следующей попыткой было увеличить ток луча и применить катод с полевой эмиссией. Для этого опять пришлось вернуться к запаянной стеклянной трубке забыв о смене образцов. Зато удалось экспериментально получить увеличение 8000х.

Вновь вернувшись к сканирующему электронному микроскопу с отключаемой вакуумной системой, Владимир Козьмич предложил следующее решение:

Расположить люминисцентный экран рядом с образцом, а уже затем детектировать испускаемые им фотоны с помощью ФЭУ (разработкой ФЭУ занималась та же компания, в которой работал Зворыкин).

Преимущество этого решения с двойным преобразованием (электроны — фотоны — электроны) в том, что можно уменьшить скорость сканирования и таким образом увеличить соотношение сигнал/шум до необходимого.

Отсюда пошёл режим медленнего сканирования (slow scan), который есть и в современных электронных микроскопах. Но из-за этого режима изображение больше не выводилось в реальном времени, а записывалось специальным факсимильным аппаратом (видимо, производства той же фирмы). И опять возникает та же проблема с настройкой фокуса, но решение ещё раньше предложил von Ardenne: наблюдая одну линию сканирования на осциллографе настраивать фокус так, чтобы преобладали высокие частоты.

Интересно то, что образец имел потенциал +800В, катод был заземлён, а электроны ускорялись анодом до 10кэВ. Таким образом, в люминисцентный экран электроны врезались с энергией 9.2кэВ. Нужно это было для работы четвёртой, иммерсионной электростатической линзы, которая должна была влиять только на вторичные электроны, а не исходный луч.

1947 г.

Palluel опубликовал работу, в которой экспериментально показал зависимость эмиссии упругоотражённых электронов от атомного номера элемента для электронного луча энергией 20кэВ. Чем больше номер, тем больше эмиссия электронов. Это явилось достаточно важным открытием, но получить первое изображение с контрастом по атомному номеру удалось лишь в 1957 г.

В настоящее время с развитием полупроводниковых детекторов отражённых электронов получить такой контраст не составляет труда. Вот, например, фотография из прошлого видео про антимонид галлия:

Даже при ускоряющем напряжении 15кВ композиционный контраст сильно заметен.

1960 г.

Thomas Everhart и Richard Thornley разработали улучшенный вариант детектора электронов, который и называется в их честь: Детектор Эверхарта-Торнли. Это самый распространённый детектор, используемый в сканирующих электронных микроскопах по сей день. Фактически, сам принцип остался неизменным с 1942 года. Новизна добавилась в детектировании упруго-отражённых электронов, где широко используются полупроводниковые датчики.

Что же такого предложили Everhart и Thornley? Схематично это выглядит так:

В вакуумной камере микроскопа рядом с образцом располагается клетка Фарадея 1. Внутри неё находится люминисцентный экран 3 (сцинтиллятор), излучающий фотоны при попадании электронов. Эти фотоны по световоду 2 выходят за пределы вакуумной камеры и попадают в ФЭУ, где на фотокатоде обратно преобразуются в электроны и многократно усиливаются за счёт эмиссии вторичных электронов на динодах внутри ФЭУ.

Чтобы не делать иммерсионную линзу, как Зворыкин, и не держать предметный столик под потенциалом 800 В, клетка Фарадея 1 выполняет функцию коллектора: на неё подаётся положительный потенциал около 200 — 400 В, который притягивает вторичные электроны с низкими энергиями, но практически не оказывает влияния на основной электронный луч.

Но электроны с энергиями порядка сотен эВ не приведут к возбуждению люминофора и излучению достаточного количества фотонов. Поэтому, на сцинтиллятор 3 (если он металлизирован, если нет, то придётся сделать вокруг него электростатическую линзу) подаётся ускоряющее напряжение порядка +12кВ, что гарантированно возбудит люминофор. Кстати, если бы не было клетки Фарадея 1, то это напряжение оказало бы значительное влияние на основной луч, сильно отклонив его.

Металлизированный сцинтиллятор.

Казалось бы, достаточно много лишних преобразований, но «просто это работает».
В начало статьи я вынес фотографию вакуумной части детектора Эверхарта-Торнли, где можно наглядно видеть клетку Фарадея, металлизированный сцинтиллятор, провода, подводящие ускоряющее напряжение и прочее.

А вот так фотоэлектронный умножитель видит окружающий мир сцинтиллятор:

В следующих сериях

Теперь можно самостоятельно изготовить детектор Эверхарта-Торнли для нашего JEOL’а, усилитель поглощённого тока, и попробовать сделать полупроводниковый детектор отражённых электронов.

P.S.

С момента первой публикации прошёл один год. За это время удалось очень многое узнать, во многом разобраться, и поделиться этим с вами. Познакомиться с очень интересными людьми, которые сильно помогли проекту. И, написать десять статей про электронный микроскоп в гараже.

Конечно, хотелось довести проект до получения первого изображения к этой дате, но был очень занят. Тем не менее, на подходе новые статьи про электронику, эксперименты с электронным лучом и много чего ещё — надеюсь, вам нравится! Сразу после выхода каждой статьи я каждые несколько минут проверяю комментарии, кто что пишет, одобряют ли, есть ли неточности, требующие исправления. На протяжении года эта обратная связь — основная мотивация продолжать работу над проектом.

С наступающим Новым Годом!

Электронный микроскоп что можно увидеть

Увидеть, как вирус проникает в клетку, узнать химический состав вещества, найти дефект кристаллической решетки — все это могут электронные микроскопы. Медицина, нефтегаз, электроника, фундаментальная наука — работа этих областей невозможна без микроскопии, которая сегодня позволяет изучать объекты даже на атомарном уровне. Достигнут ли предел?

2023-10-26T12:00
2023-10-26T12:00
2023-10-26T12:14
мы все умрём. но это не точно
сколковский институт науки и технологий
электроника
производство
Биологи и физики встают в очередь. На что способны электронные микроскопы

Увидеть, как вирус проникает в клетку, узнать химический состав вещества, найти дефект кристаллической решетки — все это могут электронные микроскопы. Медицина, нефтегаз, электроника, фундаментальная наука — работа этих областей невозможна без микроскопии, которая сегодня позволяет изучать объекты даже на атомарном уровне. Достигнут ли предел?

Биологи и физики встают в очередь. На что способны электронные микроскопы

Увидеть, как вирус проникает в клетку, узнать химический состав вещества, найти дефект кристаллической решетки — все это могут электронные микроскопы. Медицина, нефтегаз, электроника, фундаментальная наука — работа этих областей невозможна без микроскопии, которая сегодня позволяет изучать объекты даже на атомарном уровне. Достигнут ли предел?

О том, как управлять электронной пушкой, и почему процесс подготовки пробы — это искусство, рассказала руководитель Центра коллективного пользования «Визуализация высокого разрешения» Сколтеха Ярослава Шахова.Эпизод подготовлен совместно со Сколковским институтом науки и технологий.О том, как работает клеточная машинерия, можно ли включать и выключать гены, и как происходит их починка, вы можете узнать в эпизоде «Как радиация влияет на ДНК, и чем занимаются молекулярные генетики».Как, используя один и тот же химический элемент, можно получать материалы с разными свойствами, и зачем сворачивать графен в трубку, мы рассказывали в эпизоде «Нанотрубки. Почему углерод самый «крутой» химический элемент».Слушайте подкасты РИА Новости и подписывайтесь:Яндекс.МузыкаApple PodcastsCastboxGoogle PodcastsВКонтактеСкачайте выбранное приложение и наберите в строке поиска «РИА Новости» или название подкаста.А также следите за новостями и новыми выпусками в нашей группе во ВКонтакте.Как и где бесплатно подписаться на подкасты________Эпизод подготовили: Артём Буфтяк, Артур АрушанянЗвукорежиссер: Анастасия ПаниотиСпрашивайте нас, предлагайте нам, спорьте с нами: podcasts@ria.ru

Увидеть незримое и почувствовать неосязаемое. На что еще способен электронный микроскоп?

Ни для кого не секрет, что существуют вещи и организмы настолько маленькие, что увидеть их невооруженным глазом просто невозможно. Однако за последние сто лет наука шагнула далеко вперед. И теперь мы можем не только посмотреть на инфузорию, но и увидеть собственными глазами атомы, и даже, буквально, пощупать рельеф микроструктуры кристаллов. А все благодаря электронной микроскопии… Давайте разберемся, как такое возможно.

Перед вами небольшой обзор на электронные микроскопы и их возможности.

Изображение вируса Эбола, полученное при помощи просвечивающей электронной микроскопии

Несмотря на то, что «электронная микроскопия» звучит очень современно, запатентована она была еще в 1931 году германо-американским инженером и изобретателем Райнхольдом Руденбергом. Это был настоящий переворот в области изучения микроструктур.

В световом микроскопе, которым на тот момент пользовались исследователи, изображение давали световой луч и незамысловатая конструкция из оптических линз. В электронном микроскопе (ЭМ) роль луча выполнял поток электронов в вакууме, фокусируемый, словно линзами, электромагнитными катушками. Изображение передавалось на флюоресцирующий экран, где его можно было детально рассмотреть. Данная технология позволила исследовать микроструктуры твердых тел, их локальный состав, а также электромагнитные поля.

▎В чем суть электронной микроскопии?

Как уже было сказано, на исследуемый объект подается пучок электронов, который фокусируется на образце при помощи электромагнитного поля. «Точка» фокусировки электронов имеет не более 5 нм в диаметре. Для сравнения, толщина волоса — 80 000 нм. При соприкосновении с объектом электроны частично проникают внутрь, вытесняя родные электроны и фотоны образца, которые, в свою очередь, попадают на лучевую трубку, где и формируется изображение.

▎Каковы преимущества электронной микроскопии?

• Первое и основное отличие от светового микроскопа — увеличение. Профессиональный современный световой микроскоп может увеличить изображение в 2 тысячи раз. Электронный микроскоп дает увеличение до 300 тысяч при разрешающей способности 0,5 нм. На таком увеличении уже можно рассмотреть атомы.
• Второе существенное преимущество — при помощи спектрального анализа рентгеновского излучения, возбуждаемого электромагнитным полем, можно изучить химический состав образца в конкретных точках.
• В процессе можно воздействовать на исследуемый объект: облучать, нагревать, намагничивать или деформировать. И полученная картинка будет динамически изменяться.
• Имеется возможность зафиксировать процессы на фото- или видеосъемку в высоком разрешении.
• Исследователь получает электронно-оптическую информацию, которую можно дополнить данными, основанными на дифракции электронов с материалом исследуемого объекта. К примеру, определение показателей кристаллографии при использовании дифракционного контраста.
• В растровой разновидности электронной микроскопии можно рассматривать рельеф поверхности объекта при помощи анализа катодолюминесценции.

▎А каковы недостатки?

⁣ ⁣ ⁣ ⁣ ⁣ ⁣А вот недостатков много:

• Во-первых, в отличие от светового микроскопа, в котором образец можно просто поместить под окуляр, в ЭМ для работы необходим вакуум. Поэтому исследуемые образцы должны быть хорошо обработаны и зафиксированы. А потому невозможно исследовать живые объекты.
• Во-вторых, необходимо сделать ультратонкий срез исследуемого образца: от 20 до 50 нм, который к тому же должен быть равномерным. Иначе электронный поток поглотится объектом и картинки не будет.
• В-третьих, требуется высокое напряжение — от 50 кВ. А вместе с ним и специальная система охлаждения.
• Из-за повышенной чувствительности и хрупкости ЭМ нужно размещать абсолютно неподвижно, на виброустойчивой колонне, в здании без внешних магнитных полей.
• ЭМ создает исключительно черно-белые изображения.
• И, конечно, стоимость. Далеко не каждый исследовательский центр может позволить себе ЭМ. Он дорог и при покупке, и в обслуживании.

• Трансмиссионная или просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
• Растровая или сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Нитчатая водоросоль в световом микроскопе (а), СЭМ (б) и ПЭМ (в)

▎Просвечивающий электронный микроскоп

ПЭМ похож на обычный световой микроскоп, но вместо луча света используется поток электронов, а длина волны намного меньше, чем фотонная. Поэтому изображения получаются в более высоком разрешении.

Вирус свиного гриппа в просвечивающим электронном микроскопе

Фокусировка электронного потока осуществляется при помощи электромагнитных и электростатических линз. Возникают даже присущие фотонным микроскопам хроматические аберрации. Только природа такого искажения абсолютно иная. Кроме того, за счет закручивания электронов вдоль оси пучка в линзе, возникают дополнительные искажения.

У ПЭМ очень высокое разрешение, что позволяет разглядеть атомы вещества и детально рассмотреть, к примеру, возбудителя вирусного заболевания. Собственно, с появлением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА), электронным микроскопом перестали активно пользоваться для определения вирусов. И дело опять в стоимости и трудоемкости..

Из недостатков: объект, помещаемый в ПЭМ, должен быть не толще 1 микрона, то есть как один слой волоса, разрезанного вдоль на 50 частей. А вторая проблема — размер. ПЭМ занимает целую комнату: высотой в человеческий рост и с блоком питания, размером со шкаф.

ㅤㅤㅤ Просвечивающий электронный микроскоп

▎Сканирующий электронный микроскоп

СЭМ позволяет получать изображение очень высокого разрешения. Узко сфокусированный луч электронов микрон за микроном сканирует поверхность изучаемого образца. СЭМ дает возможность, в том числе, получить трехмерное изображение. У данного типа микроскопов имеется большое количество датчиков, способных улавливать все вытесняемые электронами частицы: электроны, видимый инфракрасный и ультрафиолетовый спектры света, рентгеновское излучение.

В отличие от ПЭМ, работа которого похожа на работу оптического микроскопа, работа СЭМ напоминает устройство старого телевизора. В таких телевизорах есть электронно-лучевая трубка. По ней в вакууме проходят электроны, испускаемые электронной пушкой, и есть система корректирующих движение линз, которые могут фокусировать или отклонять электроны. В СЭМ все то же самое, только электронами обстреливают исследуемый объект, а не люминофоры экрана, а вся поступающая информация фиксируется различными детекторами..

ㅤㅤ Сканирующий электронный микроскоп

У СЭМ есть несколько принципиально разных режимов работы, которые зависят от детекторов.

Рассмотрим основные виды:

• Детектор вторичных электронов

Используется для определения морфологии поверхности образца, поскольку сигнал вторичных электронов высокочувствителен к рельефу, шероховатостям и неровностям. Чаще всего данный режим работы используется в биологии для определения пор, борозд и изломов, к примеру, при изучении бактериальной клетки.

Изображение пыльцы, полученное путем детектирования вторичных электронов

• Детектор обратно отраженных или обратно рассеянных электронов

Используется для определения состава разносоставного вещества со множеством включений, поскольку сигнал рассеянных электронов чувствителен к специальному композиционному контрасту. Таким образом, на получаемом изображении, вещества разного состава в одном объекте будут иметь разные оттенки серого. Данный режим применяется, в основном, в кристаллографии и биологии.

Морфология интерфейса между оксидной и металлической составляющими, сделанная в режиме детектирования отраженных электронов

• Энергодисперсионный спектрометр

Позволяет определить элементный состав веществ и включений исследуемого образца. Конечно, в большинстве случаев важнее определить химический, а не элементарный состав. Зато энергодисперсионный спектрометр позволяет точечно, для каждого микрокомпонента определить состав. Кроме того, для данного метода не требуется никаких реагентов. Используется в химии и кристаллографии.

Анализ элементного состава микрокомпонентов полированного образца анодного шлака с помощью энергодиспрсионного спектрометра

• Детектор прошедших электронов

Электроны, прошедшие тонкий срез образца насквозь, приходят к датчику под разным углом, что дает различную информацию об исследуемом объекте. Угол рассеивания зависит от толщины среза, материала образца и энергии первичного электронного пучка. Детектор передает псевдоцветное изображение, где каждый цвет соответствует своему сигналу.

Коррозия, распространяющаяся сквозь хромовое покрытие на стали. Изображение получено при помощи детектирования прошедших электронов.

• Детектор катодолюминесцентного излучения

Используется при изучении материалов, обладающих люминесценцией, то есть способные излучать видимый свет при попадании на них электронного потока.

Катодолюминесценция — это, по сути, способность вещества замещать оставленные после облучения электронами дырки, захватывая свободные электроны и выделяя световую энергию. Это свойственно для металлов: чистых и с примесями. Свет, производимый металлом с примесью, будет другого оттенка, что и будет фиксироваться детектором..

Изображение циркона, полученное
при детектировании катодолюминесцентного излучения

СЭМ может работать исключительно с твердыми образцами в вакууме. Поэтому для работы с жидкостями, их необходимо подвергнуть глубокой заморозке. Зато форма и размер образца могут быть любыми в пределах объема рабочей камеры. Продуктивность работы повышается при нанесении на исследуемый образец тонкого слоя токопроводящего материала.

Электронная микроскопия применяется во многих сферах науки и промышленности:

Биология и медицина

При помощи ЭМ можно осуществить томографию тканей, детально рассмотреть клетки, определить локализацию белков, увидеть вирус и даже выполнить фармацевтический контроль качества.

Физика, химия и кристаллография.

ЭМ позволяет изучить микроструктуры металлов и кристаллов вещества, классифицировать материалы, тестировать характеристики различных веществ, определять состав, поверхность и плотность объектов.

Полупроводники и хранение данных
С помощью ЭМ выявляются и редактируются неисправности систем, выполняется анализ дефектов.
Промышленность

ЭМ помогает определять параметры частиц и целых структур. Позволяет в динамике посмотреть на материалы в высоком разрешении. При необходимости дает возможность построения трехмерной модели микроструктуры.

В некоторых сферах электронная микроскопия незаменима. Поэтому исследователи постоянно работают над усовершенствованием методов и возможностей в данной области. Рассмотрим некоторые из них.

▎3D моделирование

В некоторых случаях, к примеру, в биологии и медицине, могут потребоваться не просто фотографии ультратонких срезов, а трехмерные изображения какой-либо ткани или организма.

Это возможно осуществить несколькими способами:

1. ПЭМ серийных срезов

Самый первый из подходов к трехмерному моделированию на электронном микроскопе. Способ заключается в создании ленты ультратонких срезов, которые собираются на специальной сетке, покрываемой углеродом и особым веществом — формваром. Полученные изображения обрабатываются в специальной программе: создается контур, фотографии выравниваются, обрезаются и сводятся в одно трехмерное изображение. Процесс сведения трудоемкий и занимает очень много времени, а размеры изображения ограничены. Еще одной проблемой являются существенные зазоры между слоями. Кроме того, ультратонкие срезы очень хрупкие и подвержены повреждениям. И чем их больше, тем выше шанс деформации образца.

2. Криоэлектронная томография

По сравнению с ПЭМ серийных срезов, позволяет увидеть в более высоком разрешении более мелкие структуры, величиной от 3 нм, к примеру, элементы цитоскелета. Однако образцы должны быть довольно мелкими (100—500 нм) поэтому КЭТ не применима для крупных объектов и подходит только для молекулярных комплексов, вирусов и мелких бактерий.

Принцип метода криоэлектронной томографии

В процессе КЭТ объект исследования постепенно поворачивается и изображения получаются под разным углом наклона. После этого все фотографии сводятся в одно 3D изображение. Минус метода в том, что образец получает высокую дозу излучения, за счет чего часть мелких деталей теряется в процессе исследования.

3. Многоэнергетическая деконволюция

При помощи этого метода можно получить несколько изображений образца на разной его глубине, не разрушая поверхности объекта. Такой эффект достигается за счет изменения ускоряющего напряжения электронов. И чем выше энергия, тем глубже в объект может проникнуть электрон. Каждое изображение будет давать характеристику определенного слоя. А специальный программный алгоритм соберет множество срезов в трехмерную модель с максимальным разрешением до 10 нм. Помимо прочего, данный метод можно использовать совместно с методом ультратонких срезов.

4. Фокусирующая ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (ФИЛ-СЭМ)

Суть метода заключается в параллельном «разрезании» исследуемого образца на слои пучком ионов галлия и сканировании объекта электронным пучком. Слой получается толщиной 5—10 нм. Полученные изображения собираются в единую трехмерную модель.

Раскрашенное изображение бактериофагов
(зеленые), поразивших кишечную палочку (голубые), сделанное в ФИЛ-СЭМ

Сложность метода в подготовке. Перед проведением операции необходимо защитить образец от части заряда. Для этого на сам объект, к примеру, кусок органа, напыляется металл, а блок, в который заключен образец, покрывается серебряной пастой. Максимальный размер моделируемого объекта — 100*100 мкм. Кроме того, метод очень долгий, а с увеличением глубины резки снижается качество.

Принцип метода ФИЛ-СЭМ

5. СЭМ с автоматизированной лентой для сбора срезов

По сути, это улучшенная версия метода серийных срезов. Специальная насадка на ультрамикротом, который делает срезы, работает автоматически и способна делать до 1000 срезов в день, помещая их на специальную ленту. Далее лента разрезается на фрагменты, кладется на подложку, срезы обрабатываются контрастом и углеродом, после чего разрезанный образец помещается в СЭМ. Полученные изображения имеют разрешение 5 нм.

Ультрамикротом со специальной насадкой и вставленной лентой для срезов

6. Последовательная сканирующая электронная микроскопия поверхности блока

Используется для получения трехмерной модели большого объекта. Для этого ультрамикротом помещается внутрь СЭМ. В процессе происходит последовательное срезание ультратонких слоев образца с последующим сканированием. Для улучшения изображения может использоваться контраст. Преимущество данного метода заключается в величине объекта и скорости обработки информации. За получаемыми данными можно наблюдать в реальном времени.

▎Цветное изображение

Большим минусом ЭМ является черно-белое изображение. Однако и с этим ученые смогли справиться.

Самый простой метод — коррелятивная свето-электронная микроскопия (КСЭМ). Для окрашивания изображения один и тот же объект фотографируется в световом и в электронном микроскопе, а затем программа соединяет два изображения. Однако из-за разницы в разрешении изображение лишь радужно подкрашивается согласно распределению флуоресцентного красителя. Выделить микроструктуры таким образом не удастся.

Коррелятивная свето-электронная микроскопия элементов цитоскелета

Ученые объединили КСЭМ с трехмерной световой микроскопией, уже известной нам ФИЛ-СЭМ и с микроскопией сверхвысокого разрешения (СР-микроскопия), которая позволяет получить большее разрешение за счет объединения на экране множества снимков.

Срез ядер нейронов при микроскопии сверхвысокого разрешения

Составив изначально изображение высокого разрешения, ученые резали образец лучами ионов. Изображение получало цвет за счет световой микроскопии структурированного освещения, позволяющего увеличить разрешение снимка в два раза за счет поочередной подсветки отдельных точек при фоновом свечении остального образца, и одномолекулярной световой микроскопии, при которой флуоресценция красителя активируется слабым лазером. Одномолекулярная микроскопия позволяет получить изображение с разрешением 0,2 мкм. Все полученные изображения свели вместе и получили полноценные цветные снимки. С помощью данной методики удалось разглядеть, к примеру, ультраструктуру нейронов.

Трехмерные модели ядер нейронов, полученные при коррелятивной микроскопии

Итак, электронный микроскоп — вещь, во многих сферах незаменимая. Ученые потихоньку нивелируют его минусы и решают проблемы, связанные с его использованием. Возможно, в скором времени, из минусов останутся только размер и стоимость. Хотя… Может, и это исправимо?

Автор: Соловьёва Софья, микробиолог.

Использованная литература:

• Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., Лифшин Ф. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в двух книгах. Пер. с англ. — М.: Мир, 1984. 303 с.

• Уманский Я. С., Скаков Ю. А., Иванов А. Н., Расторгуев Л. Н… Кристаллография, рентгенография и электронная микроскопия. — М.: Металлургия, 1982, 632 с.

• СиндоД. Оикава. Т. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. — М.: Техносфера, 2006, 256 с. ISBN 5-94836-064-4.

• Denk, W., & Horstmann, H. (2004). Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology, 2(11).

• Efimov, A. E., Tonevitsky, A. G., Dittrich, M., & Matsko, N. B. (2007). Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: A novel device for the serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. Journal of Microscopy, 226(3), 207–217. doi.org/10.1111/j.1365-2818.2007.01773.x

• Peddie, C. J., & Collinson, L. M. (2014). Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. Elsevier Ltd. doi.org/10.1016/j.micron.2014.01.009

• Schalek, R., Kasthuri, N., Hayworth, K., Berger, D., Tapia, J., Morgan, J., … Lichtman, J. (2011). Development of High-Throughput, High-Resolution 3D Reconstruction of Large-Volume Biological Tissue Using Automated Tape Collection Ultramicrotomy and Scanning Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis, 17(S2), 966–967. doi.org/10.1017/S1431927611005708

• Wagner, J., Schaffer, M., & Fernández-Busnadiego, R. (2017, September 1). Cryo-electron tomography—the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. Wiley Blackwell. doi.org/10.1002/1873-3468.12757