Флуоресцентная спектроскопия
Методы молекулярной люминесценции — методы, в которых излучение поглощается молекулярными частицами и снова излучается при другой длине волны.
Люминесценция возникает после поглощения образцом энергии возбуждения. Молекула образца, поглощая энергию потока электромагнитного излучения (в случае фотолюминесценции), сначала переходит в возбужденное состояние. Возбуждение протекает очень быстро — 10 -15 с. Рассмотрим процессы, происходящие в молекулах более детально (см. рис. 5.33, II). Если переход заканчивается на каком-либо колебательном подуровне возбужденного уровня Е (например, на подуровне v2*), то затем происходит быстрый безызлучательный переход на самый низкий возбужденный уровень Еу При этом избыток энергии выделяется в виде тепла (см. рис. 5.33, волнистая стрелка IV).
Далее происходит возвращение молекулы на любой колебательный уровень основного состояния, которое может протекать по- разному:
- 1) молекула может передать оставшуюся энергию возбуждения при столкновении соседним молекулам, например молекулам растворителя. Этот безызлучательный процесс называется колебательной релаксацией (см. рис. 5.33, волнистая стрелка V) и происходит за Ю -10 с;
- 2) эта энергия может излучаться снова (происходит реизлучение). Процесс ее испускания в виде излучения большей длины волны носит название «люминесценция» (см. рис. 5.33, VI и VII). Излучение возникает спустя ~10 -6 —10 -8 с.
Кратковременную люминесценцию, затухающую сразу после прекращения ее возбуждения, называют флуоресценцией.
Длительную люминесценцию, продолжающуюся некоторое время после возбуждения (от 10 -4 до 10 с и больше), называют фосфоресценцией. Длины волн излучения фосфоресценции больше, чем в случае флуоресценции.
Молекулярная флуоресцентная спектроскопия. Метод, основанный на измерении интенсивности излучения, возникающего в результате поглощения молекулярной средой электромагнитного излучения другого оптического диапазона, называется методом молекулярной флуоресцентной спектроскопии (МФС).
Таким образом, в основе флуориметрического метода лежит явление флуоресценции веществ, облученных УФ-излучением. Измерение интенсивности испускаемого излучения видимого диапазона позволяет получить спектры флуоресценции — оптически возбужденные электронные спектры испускания молекул.
Отличительной особенностью спектров флуоресценции является то, что интенсивность флуоресценции зависит от интенсивности источника возбуждения, т.е. от мощности поглощенной энергии.
В качестве примера на рис. 5.55 представлены спектры поглощения и флуоресценции перилена.
Рис. 5.55. Спектры поглощения и флуоресценции перилена
Из рис. 5.55 можно выявить отличия в спектрах флуоресценции и поглощения:
- 1) полосы флуоресценции располагаются при больших длинах волн, нежели соответствующие полосы поглощения (закон Стокса и Ломмеля);
- 2) при этом наблюдается частичное перекрывание этих спектров (антистоксовская область)’,
- 3) полосы флуоресценции являются зеркальным отражением полос поглощения
Наблюдаемые явления находят следующее объяснение.
Сдвиг полосы флуоресценции в область более длинных волн, характеризующихся меньшей энергией, объясняется потерей энергии в ходе безызлучательного процесса (ее выделение в виде тепла). Поскольку АЕ1 и АЕ4 Х2.
Перекрывание спектров связано с тем, что даже при комнатной температуре верхние колебательные подуровни основного состояния в некоторой степени заселены электронами; поэтому при поглощении электромагнитного излучения возможны переходы с любого из них на нижний колебательный подуровень возбужденного состояния (vQ уровня Е — см. рис. 5.33, III). Следовательно, часть испускаемого излучения будет наблюдаться в более коротковолновой области, чем самое длинноволновое поглощение: Х1 и Х4 Ijj и / — соответственно интенсивность флуоресценции и поглощения света.
С учетом уравнения Бугера—Ламберта—Бера и последующих преобразований получим
где к — коэффициент пропорциональности; — квантовый выход флуоресценции; ? — коэффициент поглощения; ? — длина поглощающего пути; С — концентрация флуоресцирующего вещества; 7^ — интенсивность флуоресценции; /0 — интенсивность падающего излучения.
Полученное уравнение (5.48) подтверждает высказанное выше утверждение, что интенсивность флуоресценции зависит от интенсивности источника возбуждения, т.е. от мощности поглощенной энергии.
Поскольку все величины в правой части уравнения, кроме С, в условиях измерений постоянны, измеряемое значение 7^ зависит только от концентрации вещества:
Таким образом, интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации флуоресцирующего вещества (рис. 5.56, область 1).
Рис. 5.56. Градуировочный график
Однако в области относительно высоких концентраций (рис. 5.56, область 2) наблюдается явление концентрационного тушения флуоресценции: интенсивность падает вследствие безызлучательного переноса энергии от возбужденных частиц к другим молекулам при их столкновении, т.е. в результате сильного поглощения испускаемого излучения раствором. Концентрационное тушение обусловливает верхний предел диапазона определяемых концентраций ~10 -4 М.
Чувствительность метода в 10 3 —10 5 раз выше, чем в молекулярной абсорбционной спектроскопии. Это связано с тем, что в отличие от MAC, где измеряют разность двух сигналов /0 и 1>, в МФС измеряют сам сигнал 1^.
Высокая интенсивность флуоресценции объясняет низкий предел обнаружения метода, составляющий 10 -7 и даже 10 -8 %. В идеальных условиях Cmin достигает 10″ 12 М.
Воспроизводимость флуориметрических определений составляет ~5%.
Кроме того, этот метод весьма селективен, поскольку флуоресцирует меньшее число соединений, чем, например, поглощает.
Стоимость приборов ниже стоимости конкурирующих по чувствительности атомно-абсорбционных спектрофотометров.
В методах флуоресцентной спектроскопии (ФС) чаще используется принципиальная блок-схема прибора, изображенная на рис. 5.57. Такая схема позволяет принимать и измерять испускаемое излучение под прямым углом к вызывающему возбуждение потоку. Это необходимо, чтобы уменьшить помехи от рассеянного или отраженного излучения.
Рис. 5.57. Принципиальная схема прибора, используемого в флуоресцентной спектроскопии Источник: МейтисЛ. Введение в курс химического равновесия и кинематики: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. С. 424
Схема прибора, используемого в флуоресцентной спектроскопии, включает два монохроматора. Первый разлагает излучение источника и выделяет определенную узкую полосу длин волн, необходимую для получения флуоресценции. Второй монохроматор разлагает флуоресцентное излучение и используется для изучения зависимости его интенсивности от длины волны или частоты, т.е. для получения спектра флуоресценции.
Применение МФС. Метод люминесцентной спектроскопии применяется для определения большого числа минералов (например, следов урана в горных породах и природных водах), неорганических твердых люминофоров (например, твердых материалов на основе фосфатов, карбонатов, фторидов щелочных и щелочно-земельных металлов — NaF и т.п.), органических и металлоорганических соединений (особенно ароматических соединений). Возможность определять этим методом достаточно большой круг витаминов, гормонов, ферментов, антибиотиков и прочих биологически активных веществ имеет большое значение в контроле качества продукции фармацевтических производств; некоторых пестицидов — в экологическом контроле; углеводородов нефти — в контроле нефтепродуктов.
Вопросы для самоконтроля к подразделу 5.2.4
- 1. В чем состоит сущность флуоресцентной спектроскопии? Назовите области ее применения.
- 2. Расскажите о таких явлениях, как флуоресценция и фосфоресценция. Что их объединяет и в чем состоит различие?
- 3. Приведите схему прибора, используемого во флуоресцентной спектроскопии, и объясните принцип ее работы.
- 4. В чем состоят отличия спектров флуоресценции от спектров поглощения?
- 5. Какое уравнение положено в основу количественных определений в методе флуоресцентной спектроскопии? От каких факторов зависит интенсивность аналитического сигнала в этом методе?
Спектры флуоресценции и спектры возбуждения флуоресценции
Флуоресценция характеризуется двумя спектральными зависимостями:
1) спектр излучения флуоресценции (или просто спектр флуоресценции) — это зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны излучения 1 или частоты v.
Как уже упоминалось, форма спектра флуоресценции индивидуального вещества не зависит от длины волны возбуждающего света. Поэтому для возбуждения флуоресценции можно использовать как монохроматический свет, так и свет, содержащий большой диапазон длин волн (выделяемый широкополосным светофильтром). Для анализа смеси веществ целесообразно использовать монохроматическое возбуждение (см. ниже). Измерение флуоресценции лучше всего проводить с той же стороны объекта, на которую падает возбуждающий свет, с тем, чтобы минимизировать эффекты реабсорбции и экранирования. В измеренные спектры флуоресценции должна вносится поправка (если она существенна) на спектральную чувствительность детектора. Взаимное расположение элементов простейшей установки для измерения спектров флуоресценции приведено на рис.4.5А. Таким образом, по ходу луча монохроматор флуоресценции располагается после объекта.
2) спектр возбуждения флуоресценции — это зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны или частоты возбуждающего света.
На рис.4.5Б приведено взаимное расположение элементов установки для измерения спектров возбуждения флуоресценции. Как видно, в этом случае монохроматор располагается перед объектом по ходу луча и, таким образом, можно сканировать длину волны возбуждающего света. Интенсивность флуоресценции (//) зависит от интенсивности падающего света (1ол), поглощения (1-7), и квантового выхода ((pj):
В правой части квантовый выход флуоресценции для индивидуального вещества не зависит от длины волны возбуждающего света и в этом случае его можно не учитывать.
Рис.4.5. Схематическое расположение элементов спектральной установки для измерения спектров флуоресценции (А) и спектров возбуждения флуоресценции (Б). (В)- схема установки с двумя монохроматорами. И- источник света, С-светофильтр, М-монохроматор, О-объект.
Для того чтобы исключить не относящуюся к характеристикам объекта интенсивность падающего света обе части уравнения следует разделить на /од, получим:
Эта зависимость отношения интенсивности флуоресценции к интенсивности падающего света от длины волны падающего (возбуждающего) света и называется спектром возбуждения флуоресценции. При малой оптической плотности образца спектр возбуждения флуоресценции вещества совпадает со спектром оптической плотности D). Если деление интенсивности флуоресценции при каждой длине волны возбуждающего света на интенсивность возбуждающего света не предусмотрено автоматически, то для внесения коррекции необходимо прокалибровать монохроматор возбуждения по интенсивности светового потока на его выходе в относительных единицах, пропорциональных числу квантов.
Спектр возбуждения флуоресценции дает информацию по нескольким важным направлениям. Он позволяет получить спектр поглощения вещества (1-/)д, измеренный чувствительным флуоресцентным методом, проверить принадлежность флуоресценции данному веществу с известным спектром поглощения, исследовать участие вещества в процессах переноса энергии электронного возбуждения (см. ниже).
Аналогом спектров возбуждения флуоресценции при исследовании фотохимических реакций служат спектры действия — зависимость скорости фотопроцесса и от длины волны действующего света (для индивидуального вещества). Если в образце
присутствуют несколько поглощающих свет веществ, вносящих вклад в фотореакцию (в частности, посредством механизма переноса энергии), то можно определить долю участия каждого из них в фотопроцессе.
Можно как возбуждать флуоресценцию монохроматическим светом, так и измерять её интенсивность в узком спектральном диапазоне. Иначе говоря, можно использовать установку с двумя монохроматорами. Первый расположить перед объектом по ходу луча, второй — после объекта (рис.4.5В). В этом случае оказывается возможным измерять спектры флуоресценции при возбуждении в различных полосах спектра поглощения и спектры возбуждения для разных полос спектра флуоресценции. Это дает возможность идентифицировать принадлежность спектров разным веществам и исследовать перенос энергии между ними.
Количественные соотношения между флуоресценцией, поглощением и концентрацией вещества
Флуоресценцию вызывают только поглощенные кванты, поэтому её интенсивность определяется поглощением и квантовым выходом флуоресценции. Если -доля поглощения, то
(1-7); отсюда интенсивность флуоресценции равна:
Поглощение зависит от концентрации вещества. По закону Ламберта-Бера:
т.к. а поглощение
Таким образом, интенсивность флуоресценции зависит от концентрации вещества:
При низкой оптической плотности (D D при малых Д получаем:
откуда:
MCQ по флуоресцентной спектрофотометрии
Флуоресцентная спектрофотометрия Это метод, используемый для измерения интенсивности света, излучаемого образцом, когда он возбуждается светом определенной длины волны. Образец, обычно разбавленный раствор, сначала облучается лучом света определенной длины волны (длины волны возбуждения), который поглощается образцом, что заставляет молекулы в образце возбуждаться и выделять энергию в виде света ( эмиссия). Затем излучаемый свет обнаруживается и анализируется с помощью спектрофотометр. Этот процесс также известен как флуоресцентная спектроскопия. Этот метод полезен для обнаружения небольших количеств определенного соединения или белок, изучения белок-лигандных взаимодействий и изучения конформационных изменений в белки.
Объявления
MCQ по флуоресцентной спектрофотометрии
1. Какой тип излучения поглощается молекула для того, чтобы возникла флуоресценция?
Объявления
б) ультрафиолетовое излучение
в) инфракрасный свет
Объявления
2. Какое излучение испускает молекула при флуоресценции?
Объявления
б) ультрафиолетовое излучение
Объявления
в) инфракрасный свет
Объявления
3. Как называется процесс, при котором молекула возбуждается, а затем высвобождает энергию в виде флуоресценции?
4. Какой тип прибора используется для измерения флуоресценции?
5. Какой тип образца лучше всего подходит для флуоресцентной спектрофотометрии?
г) Разбавленные растворы
6. В чем разница между флуоресценцией и фосфоресценцией?
а) Флуоресценция мгновенная, а фосфоресценция замедленная
б) слабая флуоресценция и сильная фосфоресценция
в) флуоресценция носит временный характер, а фосфоресценция постоянна
г) флуоресценция в УФ, а фосфоресценция в видимом диапазоне.
7. Каково время жизни возбужденного состояния молекулы при флуоресценции?
8. Каков квантовый выход молекулы при флуоресценции?
а) Отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных фотонов
б) Отношение количества поглощенных фотонов к количеству испущенных фотонов
в) Отношение поглощенной энергии к излучаемой энергии
г) Отношение излучаемой энергии к поглощаемой энергии
9. Что такое стоксов сдвиг во флуоресценции?
а) Разность энергий между поглощенным и испущенным фотонами
б) Разность длин волн между поглощенным и испущенным фотонами
в) Разница в интенсивности между поглощенными и излученными фотонами
г) Разница в поляризации между поглощенным и испущенным фотонами
10. В чем разница между флуоресцентной и абсорбционной спектрофотометрией?
а) Флуоресценция измеряет испускание света, а абсорбция измеряет поглощение света.
б) Флуоресценция измеряет интенсивность света, а поглощение измеряет длину волны света.
в) Флуоресценция измеряет поляризацию света, а поглощение измеряет энергию света.
г) Флуоресценция измеряет флуоресценцию, а абсорбция измеряет абсорбцию.
11. В чем разница между флуоресцентной и рамановской спектроскопией?
а) Флуоресценция измеряет испускание света, а Раман измеряет рассеяние света.
б) Флуоресценция измеряет интенсивность света, а Раман измеряет длину волны света.
в) Флуоресценция измеряет поляризацию света, а Раман измеряет энергию света.
d) Флуоресценция измеряет флуоресценцию, а комбинационное рассеяние измеряет комбинационное рассеяние.
12. В чем разница между спектроскопией флуоресценции и ядерного магнитного резонанса?
а) Флуоресценция измеряет излучение света, а ЯМР измеряет магнитные свойства ядер.
б) Флуоресценция измеряет интенсивность света, а ЯМР измеряет длину волны света.
в) Флуоресценция измеряет поляризацию света, а ЯМР измеряет энергию света.
г) Флуоресценция измеряет флуоресценцию, тогда как ЯМР измеряет ядерный спин и магнитные свойства атомов и молекул.
13. Почему во флуоресцентном спектрофотометре используется флуоресцентный фильтр?
а) для поглощения нежелательного света
б) для передачи определенного диапазона длин волн света
в) рассеивать свет
г) поляризовать свет
14. Каково назначение гасителя в флуоресцентной спектрофотометрии?
а) для увеличения интенсивности флуоресценции
б) для уменьшения интенсивности флуоресценции
в) изменить длину волны излучаемого света
г) изменить поляризацию излучаемого света
15. Почему флуоресцентная спектрофотометрия полезна в биологических исследованиях?
а) Он позволяет обнаруживать очень небольшие количества конкретной молекулы
б) Это позволяет изучать взаимодействия белок-лиганд
в) Позволяет изучать конформационные изменения в белках
г) все вышеперечисленное
Ключ ответа
- б) ультрафиолетовое излучение
- а) видимый свет
- в) Возбуждение
- в) флуорометр
- г) Разбавленные растворы
- а) Флуоресценция мгновенная, а фосфоресценция замедленная
- а) микросекунды
- а) Отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных фотонов
- б) Разность длин волн между поглощенным и испущенным фотонами
- а) Флуоресценция измеряет испускание света, а абсорбция измеряет поглощение света.
- а) Флуоресценция измеряет испускание света, а Раман измеряет рассеяние света.
- а) Флуоресценция измеряет излучение света, а ЯМР измеряет магнитные свойства ядер.
- б) для передачи определенного диапазона длин волн света
- б) для уменьшения интенсивности флуоресценции
- г) все вышеперечисленное